PRÁCTICA 4 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

PRÁCTICA 4

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

OBJETIVO:

Esterilizar el material y medio de cultivo por calor húmedo, comprobando al mismo tiempo la confiabilidad de nuestros resultados y de nuestro procedimiento de trabajo.

INTRODUCCIÓN.

El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas celulares.

El principal método de esterilización que emplea calor húmedo es la esterilización por vapor a presión.

Existen otros métodos de descontaminación que emplean este tipo de calor los cuales, aunque no permiten la destrucción total de los microorganismos, disminuyen la carga microbiana que posee un material.

Esterilización por vapor a presión.

La esterilización por vapor a presión se lleva a cabo en un autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras lo que permite que la cámara alcance una temperatura de 121ºC. El tiempo de esterilización usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las características del material, es necesario variar el tiempo de esterilización.

Sólo cuando el vapor se coloca bajo presión, es cuando su temperatura aumenta por encima de los 100ºC y esto permite alcanzar las temperaturas de esterilización (121ºC).

Éste es el método de elección para esterilizar materiales termoestables y no sensibles a la humedad como medios de cultivo, cultivos de microorganismos para descartar.

FUNDAMENTO

Al aplicar a un determinado material vapor de agua a una presión de 15 lb (121ºC) por un tiempo determinado, se produce la destrucción total de los microorganismos viables presentes en el mismo.

PROCEDIMIENTO

1. Trasladar los medios de cultivo preparados en el trabajo práctico a la Sección de Medios de Cultivo.

2. Colocar los medios de cultivo dentro del autoclave.

El material debe colocarse correctamente dentro del equipo para que permita la correcta distribución del vapor de agua. Para ello se deben tomar las siguientes precauciones:

Ø Distribuir el material en forma ordenada en toda la superficie interna disponible.

Ø Evitar amontonar el material en un área específica. No colocar el material uno sobre otro.

Ø Evitar que el material toque las paredes del autoclave.

Ø No preparar cestas con tubos donde éstos se encuentren demasiado apretados.

3. Colocar la ampolla del indicador biológico en el lugar que se considere más difícil que llegue el vapor.

4. Esperar que se alcancen los 121ºC y comenzar a contar el tiempo de esterilización.

5. Cuando termine el tiempo de esterilización, apagar el autoclave.

6. Esperar que bajen la presión y la temperatura del equipo para abrirlo y retirar los medios de cultivo.

Si alguno de los medios se requiere en forma biselada (inclinado), en este momento se colocan sobre una superficie que permita obtener el grado de inclinación deseado.

7. Retirar el indicador biológico e incubarlo bajo las condiciones que señale el fabricante.

8. Esperar que el material alcance la temperatura ambiente antes de almacenarlo.

9. Después del periodo de incubación observar las características del indicador biológico.

Debido a la efectividad del método de esterilización por vapor a presión, se utilizó para eliminar todos los microorganismos que existían en los materiales de forma en que nuestros resultados serian confiables y por lo tanto el objetivo de la práctica se cumpliría satisfactoriamente

MATERIAL Y EQUIPO.

ü 2 Cajas de Petri.

ü 1 Matraz con 90 ml. de agua.

ü Papel Estraza.

ü 2 Pipetas.

ü Autoclave.

ü Cinta Masking.

ü 1 Balanza Granataria.

ü 0.94 g de Agar Estándar.

ü 1 Mechero.

ü 1 Tela de Advesto.

ü 1 Agitador.

ü 1 Soporte.

ü Alcohol de 96º.

ü Algodón.

ü Matraz erlenmeyer.

METODOLOGIA.

Para cumplir con el objetivo de esta práctica y comprobar la confiabilidad de nuestros resultados se siguieron varios pasos y procesos dentro de la práctica los cuales nos permitieron realizarla en forma satisfactoria.

El primer paso realizado una vez que se solicito y se nos entrego el material fue lavarlo y secarlo para después envolverlo en papel estraza de manera en que al sacarlo del autoclave no se contaminara pues estaría estéril y de lo contrario nuestros resultados se verían afectados, para envolverlo se busco tan solo que la parte del equipo que debía estar estéril estuviera completamente cubierta, en el caso de las pipetas, por ejemplo, enrollándolas de manera vertical y en diagonal cerrando con cinta de forma envolvente.

Una vez que el material estuvo envuelto se coloco de manera ordenada en el autoclave, la cual había sido previamente preparada, se dejo en ella por alrededor de 15 o 20 minutos, dejando escapar el vapor y cuidando la temperatura y presión. Una vez que se cumplió el tiempo requerido se espero a que los materiales y la autoclave se enfriaran para poder manipularlos.

Durante la esterilización del material se aprovecho el tiempo para la preparación del medio, una vez que se realizaron los cálculos correspondientes a la cantidad necesaria del medio que íbamos a utilizar se peso y disolvió en un matraz para después ponerlo a calentar tal y como estaba indicado en la etiqueta, por ultimo se cubrió y se metió a esterilizar también.

Una vez que todo el material estuvo preparado se procedió a esterilizar nuestra área de trabajo limpiándola primero y después colocando un poco de alcohol y encendiendo la superficie con un encendedor, se coloco un mechero para que se mantuviera de esta forma.

Dentro del área estéril se llenaron las cajas de petri con aproximadamente 20ml del medio preparado y se espero a que solidificaran en una superficie plana y fría, por ultimo se metieron a la incubadora durante 24 horas.

Después de las 24 horas se analizaron las cajas y se reportaron los resultados para después meterlas a esterilizar y desechar el medio utilizado en el depósito correspondiente.

Por ultimo se lavo, seco y entrego el material utilizado durante la práctica a las personas encargadas.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO.

Primero encendimos el autoclave.

Envolvimos los paquetes con el material a esterilizar con papel de estraza y los rotulamos, con la fecha en la que se produce la esterilización, nuestro número de equipo y mesa.

Después se coloca el material en el autoclave acomodado de forma que no tocara las paredes del autoclave.

Cerramos el autoclave.

Una vez que empezó a salir el vapor, colocamos la válvula en el autoclave, para que la presión comenzara a subir. Tiene que llegar hasta 15 lb/in2. A partir de este momento, tomamos el tiempo de 20 minutos. Cuidamos que la presión del autoclave, nunca rebase los 20 lb/in2, ni está por debajo de los 15 lb/in2. Esto lo controlamos conectando y desconectando el autoclave.

Transcurridos los 20 minutos, desconectamos el autoclave. Comenzamos a abrir la válvula para liberar el vapor y que la presión comenzara a bajar. El autoclave lo pudimos abrir únicamente cuando el manómetro marco cero. ¡Antes no ya que podría explotar!

El autoclave lo abrimos desde atrás, procurando que nadie quedara de frente hacia donde se abre la tapa, ya que salió mucho vapor caliente que causa quemaduras.

Una vez que se abrió con cuidado, sacamos los paquetes de material ayudándonos con guantes aislantes de calor.

Después se colocan en el área de trabajo, este material únicamente se debe abrir en un área aséptica.

PREPARACION Y ESTELIZACIÓN DE MEDIO

MEDIO DE CULTIVO: Agar nutritivo

Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:

Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.

Aparatos e instrumentos

ü Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.

ü Baño maría con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.

ü Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0° C, provista con termómetro calibrado.

ü Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.

Preparación:

1. Después de haber aplicado las indicaciones establecidas del medio de cultivo procedimos a calcular las cantidades necesarias para preparar el medio.
2. Ya hechos los cálculos correspondientes pasamos a pesar las cantidades del medio, es decir, 0.95g para 40 ml de agua.
3. Hacer la preparación mezclando muy bien el medio con el agua en un matraz erlenmeyer de 200 ml.
4. Calentar con agitación suave y constante hasta su completa disolución y hervir durante un minuto.
5. Dejar reposar durante algunos minutos y tapar con tapa de rosca o papel aluminio.
6. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50 °C.
7. Ya esterilizado el medio se deja reposar durante algunos minutos.
8. Para evitar la solidificación del medio se deja en baño maría hasta su uso.
9. Evitar el sobrecalentamiento del medio.
10. Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.

Procedimiento

1. Verter de 15 a 20 ml del medio fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

2. Permitir que el medio solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.

3. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.

4. Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.

5. Observar lo ocurrido y verificar los tiempos de incubación.

ESTERILIZACION DE DESECHOS BIOLOGICOS.

Una vez que pasó el tiempo establecido, se analizaron las cajas de Petrs y se anotaron los resultados correspondientes, procedimos a colocar las cajas en el autoclave para esterilizar el medio y poder desecharlo posteriormente.

Primeramente, pasamos a pedir el material que seria esterilizado, también pedimos papel estraza para envolver el material dentro de este papel y no se contamine. Llenamos el autoclave de agua, solo lo suficiente, se carga el autoclave y se aprieta la tapa manteniendo la espita de descarga abierta. Se ajusta seguidamente la válvula de seguridad a la temperatura requerida y se conecta ala fuente de calor. Cuando el agua hierva, fluirá el vapor por la espita de descarga, arrastrando con él el aire caliente existente en la cámara. Se deja que salgan libremente el aire y el vapor hasta que se haya eliminado todo el aire. Cuando se haya alcanzado esta fase, se cierra la espita de descarga aire-vapor. Cuando la carga ha alcanzado la temperatura requerida se mantiene la presión de 15 a 20 minutos. Al término del periodo de esterilización, se apaga el calentador y se deja que el autoclave se enfríe. Se abre la espita de descarga muy lentamente una vez que el indicador ha llegado a cero, se deja que el material se enfríe hasta que tenga una temperatura a la cual pueda cogerse con las manos.

Ya enfriado el autoclave y también el material esterilizado, se saco el material que fue esterilizado para poder tirar el medio en el deposito de basura correspondiente, ya que, no podemos tirarlo en el drenaje o al lavabo, porque de hacerlo, el medio se coagularía de nuevo y se solidificaría y taparía las tuberías.

Una vez que el medio fue desechado, procedimos a lavar muy bien las cajas de petri, con agua y jabón, para que no quedara ningún residuo del medio en las cajas de Petri.

Una vez lavadas, esperamos a que el material se secara para proceder a entregarlos a la persona encargada del laboratorio.

RESULTADOS.

Nosotros realizamos la esterilización de nuestro material siguiendo todas y cada una de las indicaciones así como tomando las precauciones pertinentes. No tuvimos ningún desarrollo visible de ningún tipo de microorganismos en nuestras cajas con medio de cultivo estándar y el conteo de colonias dio como resultado negativo, porque no hubo aparición de colonia alguna. Este resultado demuestra que nuestra práctica su realizo de manera correcta y que trabajamos con las medidas de higienización necesarias para poder arrojar resultados confiables sobre el cultivo de microorganismos.

CONCLUSIONES.

Después de preparar los medios y realizar toda la práctica podemos concluir que cumplimos de forma satisfactoria con el objetivo, ya que en nuestras cajas de petri no se desarrollo ningún microorganismo visible menos aun colonias, debido a esto nuestro trabajo cuenta con una gran confiabilidad, esto gracias a que el resultado de nuestro conteo fue negativo.

Otro de los objetivos cumplidos fue que el equipo aprendió a manejar el equipo utilizado comúnmente en microbiología y algunas de las técnicas empleadas también convirtiéndose en un conocimiento muy útil para un desarrollo satisfactorio de otras prácticas.

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