NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-110-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.
Introducción
Esta norma está orientada a proporcionar las guías generales para la preparación de diluciones para el examen microbiológico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este campo de aplicación, estas guías pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y para otros requerirse otros métodos diferentes. Sin embargo, en todos los casos donde sea posible se recomienda apegarse a estas guías y modificarse únicamente cuando sea necesario.
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis.
La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el procedimiento para la preparación de diluciones para el análisis microbiológico de productos alimenticios.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que se dedican a efectuar este método en alimentos nacionales o de importación, para fines oficiales.
2. Fundamento
Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos presentes en la porción de muestra.
3. Referencias
Esta norma se complementa con lo siguiente:
NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.*
4. Definiciones
Para fines de esta norma se entiende por:
4.1 Dilución primaria, es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.
4.2 Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
5. Símbolos y abreviaturas
Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:
cm centímetro
mm milímetro
g gramos
ml mililitro
l litro
pH potencial de hidrógeno
N normal
°C grado Celsius
% por ciento
h hora
6. Reactivos y materiales
6.1 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.
6.1.1 Preparación de reactivos
6.1.1.1 Solución de hidróxido de sodio 1,0 N
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Hidróxido de sodio 4,0 g
Agua 100,0 ml
Preparación:
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.
6.1.1.2 Soluciones diluyentes
6.1.1.2.1 Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Fosfato de sodio monobásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
Llevar a un litro con agua.
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.
Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.
Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
6.1.1.2.2 Agua peptonada
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 1,0 g
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15 minutos.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
6.2 Materiales
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h a 170 a 175°C o 1 h a 180°C o
Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.
7. Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.
8. Procedimiento
8.1 Preparación de la dilución primaria.
8.1.1 A partir de muestras líquidas:
Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).
Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
8.1.1.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
8.1.1.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describió anteriormente
8.1.2 A partir de muestras sólidas o semisólidas.
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis.
8.1.2.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.
8.1.2.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.
8.1.2.3 Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.
8.1.2.4 Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas superiores de la suspensión.
Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.
El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
8.2 Preparación de las diluciones decimales adicionales.
8.2.1 Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
8.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe en 8.1.1.1.
8.2.3 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
8.2.4 Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
8.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido.
8.2.6 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.
El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es:
Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 ml de la dilución más alta.
Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en
8.3 Duración del procedimiento.
En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA
Introducción
Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización en su metabolismo de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor, alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad para alterar sustratos desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia prima inadecuada.
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el método general para determinar el número de mohos y levaduras viables presentes en productos destinados al consumo humano por medio de la cuenta en placa a 25 ± 1°C.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional para las personas físicas o morales que requieran efectuar este método en productos nacionales o de importación, para fines oficiales.
2. Fundamento
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.
3. Referencias
Esta Norma se complementa con lo siguiente:
NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.*
NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.*
NOM-092-SSA1-1994 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.*
4. Definiciones
Para fines de esta Norma se entiende por:
4.1 Colonias, agrupamiento de células en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo.
4.2 Levaduras, son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca.
4.3 Mohos, grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25 °C.
4.4 Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.
5. Símbolos y abreviaturas
Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:
mm milímetro
µm micrómetro
g gramo
ml mililitro
pH potencial de hidrógeno
N normal
°C grado Celsius
% por ciento
UFC unidades formadoras de colonias
l litro
h hora
6. Reactivos y materiales
6.1 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.
6.1.1 Medios de cultivo.
Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada.
Preparación del medio de cultivo.
Seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C, acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 ml de ácido tartárico por 100 ml de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro. Dejar solidificar una porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado.
A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido tartárico.
6.1.2 Soluciones.
6.1.2.1 Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Fosfato de potasio monobásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.
Llevar a 1,0 l de agua.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a 1,0 l con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos.
6.1.2.2 Solución estéril de ácido tartárico al 10%
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Acido tartárico 10,0 g
Agua destilada 100,0 ml
Preparación:
Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por filtración a través de membrana de 0,45 µm.
6.2 Materiales.
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
Cajas Petri.
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
7. Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro calibrado.
Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0°C.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
Registrador mecánico o electrónico.
Microscopio óptico.
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
8. Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en
9. Procedimiento
9.1 Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
9.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
9.3 Verter de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
9.4 Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.
9.5 Preparar una caja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad.
9.6 Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.
9.7 Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis.
9.8 Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.
10. Expresión de resultados
Cálculo del Método
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de
11. Informe de la prueba
Informar:
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
12. Concordancia con normas internacionales
Esta Norma no tiene concordancia con normas internacionales.
Introducción
El grupo de los microorganismos coliformes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.
El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
- La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos.
- La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.
- Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo.
- La calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.
- La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales.
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el método microbiológico para determinar el número de microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la técnica de cuenta en placa.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que requieran efectuar este método en productos nacionales o de importación, para fines oficiales.
2. Fundamento
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
3. Referencias
Esta Norma se complementa con lo siguiente:
NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.*
NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.*
NOM-092-SSA1-1994 Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.*
NOM-112-SSA1-1994 Determinación de Bacterias Coliformes. Técnica del Número más Probable.*
4. Definiciones
Para fines de esta Norma se entiende por:
Coliformes, bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 ºC fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares.
5. Símbolos y abreviaturas
Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:
h hora
g gramo
ml mililitro
l litro
mm milímetro
ºC grado Celsius
% por ciento
pH potencial de hidrógeno
N normal
RVBA agar-rojo-violeta-bilis-lactosa
1/d inversa de la dilución
UFC unidades formadoras de colonias
/ por
6. Reactivos y materiales
6.1 Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.
6.1.1 Soluciones diluyentes
6.1.1.1 Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Fosfato monopotásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
Llevar con agua a un litro.
Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0°C.
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
6.1.1.2 Agua peptonada
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 1,0 g
NaCl 8,5 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.
Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
6.1.2 Medio de cultivo
Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA)
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Peptona 7,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Lactosa 10,0 g
Sales biliares 1,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Rojo neutro 0,03 g
Cristal violeta 0,002 g
Agar 15,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor.
Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C.
Evitar el sobrecalentamiento del medio.
No debe esterilizarse en autoclave.
Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.
En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.
6.2 Materiales
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.
Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
Cajas Petri.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h a 170 - 175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0°C.
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser químicamente inerte.
7. Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1° C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0° C, provista con termómetro calibrado.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
Registrador mecánico o electrónico.
Microscopio óptico.
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
8. Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994 "Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".
9. Procedimiento
9.1 Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
9.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
9.3 Vertir de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
9.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.
9.5 Preparar una caja control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.
9.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.
9.7 Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.
9.8 Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.
9.9 Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.
10. Expresión de los resultados
10.1 Cálculo del método
10.1.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características.
Separar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o por gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.
10.1.2 Placas que contienen menos de 15 colonias características.
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido de la dilución correspondiente.
10.1.3 Placas con colonias no características.
Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por gramo, en donde d es el factor de dilución.
11. Informe de la prueba
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h.
En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1.
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por ml".
12. Concordancia con normas internacionales
Esta Norma no tiene concordancia con normas internacionales.
5. Harinas de cereales, sémolas o semolinas
5.1 Disposiciones Sanitarias
Los cereales que se empleen como materia prima en la elaboración de los productos objeto de este apartado deben ajustarse a la siguiente disposición:
5.1.1 El productor de grano, el comercializador del mismo y el industrial, cada uno en el ámbito de su responsabilidad deben observar que los plaguicidas que se empleen en el tratamiento de granos y semillas almacenados, en medios de transporte, en áreas de almacenamiento, espacios vacíos y para el control de roedores, así como para la desinfestación y protección de granos almacenados a granel o en costales, cumplan con los límites de uso y no excedan los niveles máximos residuales establecidos en el Catálogo Oficial de Plaguicidas vigente.
5.2 Especificaciones Sanitarias
Los productos objeto de este apartado, además de sujetarse a lo establecido en el Reglamento deben cumplir con las siguientes especificaciones:
5.2.1 Físicas
| Determinación | Límite máximo |
| Humedad | 15% |
| Materia extraña | No más de 50 fragmentos de insectos, no más de un pelo de roedor y estar exentos de excretas, en 50 g de producto. |
5.2.2 Microbiológicas
| | Mesofílicos aerobios | Coliformes | Mohos |
| Harina de trigo, sémolas o semolinas | 50,000 | 150 | 300 |
| Harina de maíz | 100,000 | 100 | 1000 |
| Harina de maíz nixtamalizada | 50,000 | 100 | 1000 |
| Harina de centeno | 100,000 | 100 | 200 |
| Harina de cebada | 100,000 | 100 | 200 |
| Harina de avena | 50,000 | 50 | 100 |
| Harina de arroz | 100,000 | 100 | 200 |
| Harinas integrales | 500,000 | 500 | 500 |
* Uso exclusivo como aditivo, no como nutrimento.
5.2.5.2 Enzimas.
En la elaboración de los productos objeto de este apartado se pueden emplear únicamente las enzimas listadas en el Reglamento, derivadas de las fuentes que ahí se establecen y conforme a las BPF.
5.3 Especificaciones nutrimentales.
5.3.1 La harina de trigo debe ser adicionada con 2 mg de ácido fólico/kg de harina y 35 mg de hierro (como ion ferroso) /kg de harina.
6. Alimentos a base de cereales, de semillas comestibles, harinas, sémolas o semolinas o sus mezclas
6.1 Disposiciones Sanitarias.
Los productos señalados en este apartado, además de cumplir con lo establecido en el Reglamento, deben ajustarse a la siguiente disposición:
6.1.1 La materia prima que se utilice en la elaboración de estos productos debe cumplir con los límites de aflatoxinas establecidos en el numeral 5.2.3 de este ordenamiento.
6.2 Especificaciones sanitarias
Los productos objeto de este apartado, deben cumplir con las siguientes especificaciones:
6.2.1 Microbiológicas.
| ESPECIFICACIONES | LIMITE MAXIMO |
| Mesofílicos aerobios | 10 000 UFC/g |
| Coliformes totales | <30> |
| Mohos | 300 UFC/g |
7.3 Especificaciones sanitarias.
7.3.1 Microbiológicas.
7.3.1.1 Para el pan blanco, pan de harinas integrales y productos de bollería:
| ESPECIFICACIONES | LIMITE MAXIMO |
| Mesofílicos aerobios | 1000 UFC/g |
| Coliformes totales | <10> |
| Mohos | 20 UFC/g |
| Levaduras | 20 UFC/g |
7.3.1.2 Pan dulce.
| ESPECIFICACIONES | LIMITE MAXIMO |
| Mesofílicos aerobios | 5000 UFC/g |
| Coliformes totales | 20 UFC/g |
| Mohos | 50 UFC/g |
| Levaduras | 50 UFC/g |
| Staphylococcus aureus * | <> |
* Debe determinarse únicamente en el producto que contenga relleno o cobertura a base de huevo, frutas, leche, crema pastelera u otro alimento preparado.
7.3.1.3 Galletas
| ESPECIFICACIONES | LIMITE MAXIMO |
| Mesofílicos aerobios | 3000 UFC/g |
| Coliformes totales | <10> |
| Mohos | 20 UFC/g |
| Levaduras | 20 UFC/g |
7.3.1.4 Galletas con relleno o cobertura o sus combinaciones.
| ESPECIFICACIONES | LIMITE MAXIMO |
| Mesofílicos aerobios | 5000 UFC/g |
| Coliformes totales | 20 UFC/g |
| Mohos | 50 UFC/g |
*** Su uso está limitado a dicha concentración tanto como humectante como edulcorante. La etiqueta del producto que contenga este aditivo alimentario se ajustará a lo establecido en la NOM-086-SSA1-1994 (véase referencias).
2. Método para la determinación de materia extraña ligera en harina de trigo
2.1 Fundamento.
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácida, el material considerado como materia extraña ligera se captura por flotación en aceite mineral y posteriormente retenido en papel filtro para su observación al microscopio.
2.2 Reactivos y materiales.
Todos los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación.
Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.
2.2.1 Reactivos.
2.2.1.1 Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza, con un peso específico de 1,185 - 1,192.
2.2.1.1.1 Acido clorhídrico al 3%. Diluir 3 volúmenes de ácido clorhídrico en 97 volúmenes de agua (v/v).
2.2.1.2 Solución de detergente al 5% (p/v).
2.2.1.2.1 En un vaso de precipitados de 100 ml pesar 5 g de laurilsulfato de sodio.
2.2.1.2.2 Disolver con agua y trasvasar cuantitativamente a un matraz volumétrico de 100 ml enjuagando varias veces con agua y llevar al aforo.
2.2.1.3 Aceite mineral ligero con un peso específico (24°C) de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40°C) de 45 - 55 cSt.
2.2.1.4 Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1:3
(v/v) (C3H5) (OH)3 - C2H5-OH)
2.2.1.4.1 Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico.
2.2.2 Materiales.
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml
Matraz Kitazato
Embudo Büchner
Embudo percolador o embudo Kilborn
Caja Petri
Aguja de disección
Parrilla de calentamiento con agitación
Papel de filtración rápida rayado para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
Material común de laboratorio.
2.3 Equipo.
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad
Equipo de filtración al vacío
Agitador magnético
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10X y oculares apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100X respectivamente.
Lámpara para el Microscopio o luz natural equivalente.
2.4 Procedimiento.
2.4.1 Digerir por triplicado 50 g de harina en un vaso de precipitados de 2000 ml con 600 ml de ácido clorhídrico al 3% en un autoclave por 5 min a 121°C. Dejar que la presión baje a cero y abrir la válvula de ventilación. Transferir inmediatamente el digerido a un vaso de precipitados de 1000 ml, enjuagando con ácido clorhídrico al 3% a temperatura ambiente.
2.4.2 Adicionar 50 ml de aceite mineral y agitar magnéticamente por 5 min, transferir a un embudo percolador conservando el vaso. Dejar reposar por 30 min y agitar muy suavemente con una varilla de vidrio varias veces, durante los primeros 10 min.
2.4.3 Drenar la capa inferior hasta aproximadamente 3 cm de la interfase. Lavar los lados con agua fría y dejar que las capas se separen por un tiempo aproximado de 2 a 3 min. Repetir el drenado y lavado con agua hasta que la fase inferior esté clara. Después del lavado final, drenar la capa de aceite en el vaso original y enjuagar los lados del embudo con agua y alcohol etílico.
2.4.4 Agregar ácido clorhídrico al 3% y llevar a ebullición por 3 a 4 min en una parrilla de calentamiento. Filtrar (usando un embudo Büchner y sistema de vacío) la solución caliente a través de un papel filtro rayado y enjuagar perfectamente el vaso y embudo con agua, alcohol y una solución de detergente al 5%. Filtrar en forma separada cada enjuague a través del mismo papel filtro.
2.4.5 Examinar el papel en el microscopio como en el método No. 1 según los puntos 1.4.7 al 1.4.11.
2.4.6 Reportar el promedio de las 3 determinaciones como fragmentos de insectos, pelos de roedor y alguna otra materia extraña ligera encontrados en 50 g de muestra.
6. Método para la Determinación de Humedad y Sólidos Totales en Harina
6.1 Fundamento
Cuando un producto es sometido a secado en condiciones específicas, presenta una pérdida de peso, debido a la evaporación del agua que contiene, la cual se reporta como valor de humedad.
6.2 Material
Cajas de aluminio de 55 mm de diámetro por 15 mm de altura, con tapa.
Desecador hermético con agente desecante apropiado, tales como silica gel, cloruro de calcio o equivalentes y excluyendo el ácido sulfúrico.
Pinzas de crisol.
6.3 Equipo
Balanza analítica con sensilibidad de 0,0001 g
Estufa de secado capaz de mantenerse a 130 ± 3ºC y provista de un orificio para ventilación.
6.4 Procedimiento
6.4.1 Pesar 2 g de harina en una caja de aluminio la cual previamente se ha secado por una hora a 130 ± 3ºC y enfriada en desecador durante una hora.
6.4.2 Colocar la caja con la muestra dentro de la estufa y secar durante una hora a 130 ± 3ºC. El tiempo debe empezar a contar a partir de que la temperatura en la estufa con la muestra alcance los 130 ± 3ºC. La caja deberá estar semitapada.
6.4.3 Después de una hora, tapar la caja dentro de la estufa. Sacar la caja y colocarla en el desecador y dejarla enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente (aproximadamente una hora).
6.4.4 Una vez que se haya enfriado pesarla y reportar la pérdida de peso como humedad, y el residuo de la harina como Sólidos Totales.
6.5 Cálculos
| (A-B) x 100 | | |
| | % Humedad = ----------------------- | |
| | | W |
| | % Sólidos Totales = 100 - % Humedad | |
En donde:
A = Peso de la caja con muestra en g
B = Peso de la caja con muestra desecada en g
W = Peso de la muestra en g
6.6 Repetibilidad
La diferencia entre dos resultados sucesivos obtenidos en las mismas condiciones en la misma muestra no debe exceder de ± 0,2%. En caso contrario repetir las determinaciones.
6.7 Precauciones
El agente desecante debe estar en buenas condiciones.
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